АВТОРЫ:

Старший эмбриолог, кандидат сельскохозяйственных наук Машталер Д.В.

Доктор сельскохозяйственных наук Голубец Л.В.

Кандидат сельскохозяйственных наук Дешко А.С.

Главный биотехнолог Хромов Н.И.

Впервые трансвагинальная аспирация ооцитов (ТАО), по международной классификации OPU (Ovum Pick-Up), у крупного рогатого скота была проведена командой датских исследователей во главе с Callesen H. в 1987 г., по результатам которой после пункции 38 фолликулов у 7 су- перовулировавших (стимулированных на суперовуляцию) телок было получено 16 ооцитов.

Технически процедура выглядит следующим образом. Держатель зонда с ультразвуковым датчиком помещают во влагалище и располагают перед шейкой матки. Ультразвуковой датчик обеспечивает визуализацию яичника и расположенных в корковом слое фолликулов. Далее одну руку вводят в прямую кишку животного и манипулируют яичником относительно передней части влагалища в непосредственной близости от шейки матки. Другой рукой в вагину продвигают держатель зонда, и по мере выдвижения иглы вперед она проводится через стенку влагалища и направляется в фолликулы. Извлечённая фолликулярная жидкость, содержащая ооциты, по системе шлангов направляется и накапливается в подогреваемой ёмкости.

Стоит отметить, что получение ооцитов методом трансвагинальной аспирации способствует не только более эффективному использованию животных, имеющих ценное хозяйственное значение, но и даёт возможность получения большого числа компетентных ооцитов с одинаковым физиологическим статусом. Что в последующем определяет успех метода.

Собственные исследования

Методы исследования

Серия производственных опытов проводилась на донорском стаде центра по трансплантации эмбрионов ООО «Бетагран – Липецк» и делилась на несколько этапов. Пункцию фолликулов проводили с использованием ультразвуковой системы AlokaSSD 500, включающей в себя ультразвуковой сканер Aloka Prosound 2, ультразвуковой излучатель с частотой 89 MHz, вакуумную помпу Craft suction unit, держатель ультразвукового излучателя, иглы длиной 55 см и диметром 18G. Скорость аспирации фолликулярной жидкости составляла 25 мл/мин. В качестве промывной жидкости использовали фосфатно солевой буфер Дюльбекко с добавлением 100 ед/мл гентамицина и 0,5 % эстральной сыворотки. Локализацию ооцит-кумулюсных комплексов проводили с помощью фильтровальной системы EmSafe для вымывания КРС и лошадей. Поиск и оценку качества полученных ооцитов осуществляли под лабораторной стереоскопической бинокулярной лупой Olympus sz 51 при 16- и 90-кратным увеличении. Пригодные ооциты делили на 4 категории. А-отличные, B-хорошие рис.1, С-удовлетворительные, рис.2, D-условно годные рис 3.

Рис.1 Ооциты группы А и В


Рис.2 Ооциты группы С


Рис.3 Ооциты группы D


Рис.4 Ооциты общий сбор

Влияние донора на количество извлекаемых ооцитов остаётся по-прежнему дискуссионной темой и требует изучения. Для этого были отобраны 22 головы коров голштинской породы, от каждого животного были получены ооцит–кумулюсные комплексы. Количество аспираций на донора составило от 7 до 15 процедур. Таким образом получено всего 1335 ооцитов. Из них отличных и хороших 265 шт., количество ооцитов удовлетворительных и условно годных составило 649 шт. Всего пригодных получено 914 шт. или 68,46 % от числа извлечённых. Показатели выхода ооцитов отражены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние индивидуальных особенностей донора на эффективность аспирации ооцитов

п/п

Донор

Количество

аспираций

Аспирировано

фолликулов,

n-%

Получено ОКК

Кол-во

ОКК на

аспирацию

всего


отличных

хороших

Удовлетворит.

условногодных

всего

пригодных

не

пригодных


всего

приг

1

117184

15

74

77

25

38

63

14

4,9

4,3

2

1105

13

59

48

16

18

34

14

3,6

2,6

3

1754

17

84

90

18

43

61

29

5,2

3,5

4

4288

13

62

48

15

22

37

11

3,6

2,8

5

4532

15

71

63

16

35

51

12

4,2

3,4

6

4805

15

83

109

15

51

66

43

7,2

4,4

7

4853

15

63

56

15

29

44

12

3,7

2,9

8

5851

7

15

18

6

4

10

8

2,5

1,4

9

5908

13

53

49

13

21

34

15

3,7

2,6

10

17784

16

85

125

45

64

109

16

7,8

6,8

11

121382

16

98

118

35

57

92

26

7,3

5,7

12

117535

11

46

18

3

7

10

8

1,6

0,9

13

184966

11

63

68

1

26

27

41

6,1

2,4

14

330564

11

70

68

2

41

43

25

6,1

3,9

15

247521

11

41

32

4

9

13

19

2,9

1,1

16

184849

11

76

102

9

51

60

42

9,2

5,4

17

4104

10

54

52

7

23

30

22

5,2

3

18

1315

6

20

19

4

8

12

7

3,1

2

19

801023

11

56

41

3

26

29

12

3,7

2,6

20

117217

8

40

49

3

31

34

15

6,1

4,2

21

4805

10

40

41

2

21

23

18

4,1

2,3

22

432

11

45

44

8

24

32

12

4

2,9

итого

264

1298

1335

265

649

914

421

5

3,4

Можно сделать вывод, что количество, а также выход пригодных ооцитов является величиной не одинаковой и зависит от индивидуальных особенностей донора.

Возможность получения большего числа ооцитов за одну аспирацию, а также сокращение интервала между ними имеют важное практическое значение. Проведение пункций по забору ооцитов с интервалом два раза в неделю отмечено и в работах ряда зарубежных исследователей. Согласно опытам, проведённым R. Boni сравнение этих двух подходов к получению ооцит – кумулюсных комплексов подтвердило, что двукратная аспирация повышала как выход ооцитов, так и выход качественных эмбрионов. P. Bols, так же отмечает повышение качества ооцитов при 2-х кратной аспирации. Предполагая, что это связано по всей видимости, с тем, что 2-х кратная в неделю аспирация стимулирует и синхронизирует новые волны роста фолликулов.

Для этого были отобраны 22 головы коров доноров и разделены на две опытные группы по 11 голов в каждой. Результаты опытов отражены в таблице 2. Пункция фолликулов проводилась с интервалом в 3 и 7 дней на протяжении 18 месяцев. За этот период была осуществлена 291аспирация донорского стада. Было получено всего ооцитов 1386 шт., из них отличных/хороших 273 шт., удовлетворительных/условно годных 664 шт., всего непригодных 442 шт.

Таблица 2. Влияние частоты аспираций на их эффективность


Изучение влияния кратности аспираций на выход и качество гамет показало, что у 11 доноров семи дневной группы за 180 процедур количество пригодных ооцитов составило 570 шт., что равняется 67% от числа полученных. Суммарный выход ооцитов на одну аспирацию составил 4,6 от числа полученных. Выход пригодных ооцитов равнялся 3,1 на донора.

Во втором случае от 11 доноров трёхдневной группы за 111 процедур количество пригодных ооцитов составило 303 шт., что равняется 56% от числа полученных. Или же на 11 % меньше по сравнению с первой группой. Суммарный выход ооцитов на одну аспирацию составил 4,8 от числа полученных, что на 0,2 больше по сравнению с первой группой. Выход пригодных ооцитов равнялся 2,7 на донора, что на 0,4 меньше по сравнению с первой группой.

Схожие данные были получены и при использовании этих двух подходов (через три и семь дней) на одних и тех же донорах. Что отражено в таблице 3. Для опыта были отобраны 8 доноров. Всего проведено 77 аспираций. Получено ооцитов всего 452 шт., из них пригодных 325 шт., что составило 71,90% от числа полученных. Количество ооцитов на одну аспирацию составило всего 5,8 выход пригодных 4,2.

На этих же донорах при однократной аспирации проведено 97 процедур. Получено ооцитов всего 623 шт., всего пригодных 445 шт., что составило 71,14% от числа полученных. Общее количество полученных ооцитов на донора было на 0,6 больше по сравнению с первой группой и составило 6,4. Количество пригодных было на 0,3 больше по сравнению с первой группой и составило 4,5 на донора.

Таблица 3. Влияние частоты аспирации на ее эффективность в разрезе доноров

п/п

Частота аспираций

Количество

аспираций


Аспирировано

фолликулов,

n-%

Получено ОКК

Выход ОКК

на аспирац

всего


отличных

хороших

удовлетворит.

условногодных

всего

пригодных

не

пригодных

всего

приг

1

Через 3дня

12

60

58

16

26

42

8

4,8

3,5

Через 7 дней

15

79

88

23

48

80

17

5,8

5,3

2

Через 3дня

10

54

52

7

23

30

22

5,2

3,0

Через 7 дней

15

92

184

50

98

148

36

12,2

9,8

3

Через 3дня

11

63

68

1

26

27

41

6,1

2,4

Через 7 дней

5

19

32

3

13

16

16

6,4

3,2

4

Через 3дня

11

60

63

18

34

52

11

5,7

4,7

Через 7 дней

10

42

36

2

6

8

28

3,6

0,8

5

Через 3дня

9

49

51

17

23

40

11

5,6

4,4

Через 7 дней

13

59

48

16

18

34

14

3,6

2,6

6

Через 3дня

7

47

51

11

31

42

9

7,2

6,0

Через 7 дней

11

49

69

21

30

51

18

6,2

4,6

7

Через 3дня

9

72

61

9

44

53

8

6,7

5,8

Через 7 дней

15

83

109

15

51

66

43

7,2

4,4

8

Через 3дня

8

52

48

9

30

39

9

6,0

4,8

Через 7 дней

13

56

57

17

25

42

13

4,3

3,2

ИТОГО

Через 3дня

77

457

452

88

237

325

119

5,8

4,2

Через 7 дней

97

479

623

147

289

445

185

6,4

4,5


Как видно из результатов таблиц, влияние частоты аспирации на ее эффективность в разрезе доноров также не показало значительных различий. Таким образом стоит обратить внимание, что за счёт укороченного интервала при двух кратной аспирации, разница в количестве и качестве будет компенсироваться за счет частоты получения ооцит кумулюсные комплексов, что позволит более эффективно использовать животное.

Производственное долголетие донора имеет важное значение. Микротравмы влагалища и коркового слоя яичника которые образуются вследствие проколов могут негативно сказываться на здоровье репродуктивного тракта животного. Для этой цели нами был проанализирован широкий спектр информации о который отражал два показателя. Первое это суммарное количество аспираций за всё время использования донора и второе это изменение качества и количества ооцитов за всё время работы с донором.

Таблица 4. Влияние количества аспираций на их эффективность

п/п

Количество

аспираций

Количество доноров

Аспирировано

фолликулов,

n-%

Получено ОКК

Выход пригодных от числа полученных в %

всего


отличных

хороших

удовлетворит.

условногодных

всего

пригодных

не

пригодных

1

1-10.0

6

203

197

56

93

149

48

75,60%

2

10.1-20.0

7

462

516

139

239

378

138

73,25%

3

20.1-30.0

3

486

403

120

220

340

63

84,36%

4

30.1-40.0

3

416

431

86

223

309

122

71,69%

5

40.1-50.0

3

546

447

115

212

327

120

73,15%

6

более 50.0

5

1730

2121

359

974

1333

788

62,84%

Итого:

27

3870

4115

875

1961

2836

1279

68,91%

Для анализа были использованы данные о 27 донорах которые аспирировались от 1-10.0 до 50.0 и более 50.0 раз. В сумме за этот период было получено всего 4115 ооцитов. Из них 2836 пригодных, что составило 68,91% от количества полученных. Как видно из данных таблицы 4 выход пригодных от числа полученных в промежутке от 1 до 50 аспираций не имел значительных отклонений в худшую сторону и оставался практически на одном и том же уровне. И в среднем составил 75,00%. В тоже время данные по пяти донорам аспирированных более 50-ти раз показывают снижение числа пригодных ооцитов до 62,80%, а вот количество непригодных ооцитов значительно возрастало и в некоторых случаях составило уже 59,00% от числа полученных.

На рис. 5, 6 и 7 визуально отражена динамика получения ооцитов у коров доноров. При этом количество аспираций донора составляет от 83 до 95. Примечателен тот факт, что на момент подведения статистики эти доноры находились в стаде и использовали для получения ооцитов. На сегодняшний день разрабатывается методика восстановления репродуктивной системы донора после многочисленных аспираций.

Рис. 5 График эффективности использования донора №432


Рис. 6 График эффективности использования донора №4104


Рис. 7 График эффективности использования донора №1315


Выводы: Согласно результатам опытов количество пригодных ооцитов, получаемых от доноров единица не постоянная и сугубо индивидуальная. В нашем случае эта цифра колебалась от 0,9 до 5,4 ооцита на донора. Возможно получение жизнеспособных ооцитов при проведении пункции фолликулов с интервалом раз в три дня. Использование доноров в среднем до 50 раз не значительно влияло на выход и качество получаемых ооцитов. Увеличение количества аспираций свыше 50-ти и до 100 снижало выход жизнеспособных ооцитов с 75.00% до 62.80% и увеличивало выход непригодных с 24,60 % до 59,0%.



Старший эмбриолог, кандидат сельскохозяйственных наук Машталер Д.В.

Доктор сельскохозяйственных наук Голубец Л.В.

Кандидат сельскохозяйственных наук Дешко А.С.

Главный биотехнолог Хромов Н.И.



Литература:

1.Boni, R. Ovum Pick-Up and embryo production in vitro: an established procedure in cattle / R. Boni [et al.] // In: Proceedings of the VIII Congress. European Embryo Transfer Association / AETE. - France. Lyon, 1992. - P. 128.

2.Boni, R. Health and some blood parameters in cows punctured twice weekly during three months to collect immature oocytes / R. Boni [et al.] // In: Proceedings of the IX Congress. European Embryo Transfer Association / AETE. - France. Lyon, 1993. - P. 136.

3.Boni, R. Follicular dynamics, repeatability and predictability of follicular recruitment in cows submitted to repeated follicular puncture / R. Boni [et al.] // Theriogenology. – 1997. – Vol. 48. – P. 277-289.

4. Callesen, H. Ultrasonically guided aspiration of bovine follicular oocytes / H. Callesen, T. Greve, F. Christensen // Theriogenology. – 1987. Vol. 27. – P. 217.

5. Imai, K. Effect of the frequency of ovum pick-up intervals on follicle number, oocyte recovery and embryo production rates in cattle / K. Imai [et al.] // Theriogenology. – 2000. – Vol. 53. – P. 359.

6. Pieterse, M.C. Repeated transvaginal ultrasound-guided ovum pick-up in ECG-treated cows / M.C. Pieterse [et al.] // Theriogenology. – 1992. – Vol. 37. – P. 273.

7. Kruip, T. Potential use of Ovum Pick-Up for embryo production and breeding in cattle // T. Kruip [et al.] // Theriogenology. – 1994. – Vol. 42. – P. 675-683.

Мнение редакции может не совпадать с мнением автора

Чтобы оставить комментарий, пожалуйста, авторизуйтесь

04.12.2018

Кому ЭВС?

Минсельхоз хочет во втором квартале 2019 года включить готовую молочную продукцию в систему электронной ветеринарной сертификации. Что об этом думают молочники - выясняло The DairyNews.
06.12.2018 21:34:45

про ацидоз про ножи

0 55 Алексей Николаевич Ковалев
Маяк Высокое, ОАО
Адрес:  Беларусь, Витебская область, Оршанский район, деревня Купелка 
 
Фаэтон-Агро, ООО УК
Адрес:  Ленинградская область, Гатчинский район, дер.М.Верево, ул.Кутышева, д.6В 
 
Бурановское, ООО
Адрес:  Алтайский кр, Усть-Калманский район, с. Новобураново, ул. Октябрьская, д. 10 корп. 
 
МК Братовщина (Агрофирма Трио, ООО)
Адрес:  Липецкая область, с. Братовщина